É assim que Anticorpos Neutralizantes são detectados
Anticorpos neutralizantes (NAbs) são anticorpos (imunoglobulinas) que neutralizam qualquer efeito biológico que uma partícula infectante possa ter, deixando-a inativa.
Eles fazem parte da imunidade adaptativa humoral contra vírus, bactérias intracelulares e toxinas de micro-organismos.
Ao se ligar a estruturas de superfície do agente infeccioso, eles previnem que haja interação desse com as células do hospedeiro. Caso contrário, essas células seriam infectadas e destruídas.
Por exemplo, os NAbs produzidos na COVID-19 ligam-se no domínio RBD da proteína S (spike) do SARS-CoV-2. Isso faz com que o vírus não ligue-se ao seu receptor ECA2, impedindo a sua entrada na célula-alvo.
Porém, nem todos os anticorpos produzidos contra a proteína S do vírus são capazes de neutralizá-lo.
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Anticorpos não neutralizantes
Nem todo anticorpo tem a capacidade de neutralizar um agente infeccioso, ou seja, impedir sua infectividade independente da presença de células imunes.
Mas, eles atuam de outras formas, como por exemplo opsonizando (marcando) o patógeno e/ou ativando o sistema complemento, com consequente ativação de células imunes como os fagócitos e linfócitos.
A diferença é que, aqui, os anticorpos ligam-se a outras regiões/proteínas do patógeno.
Detecção laboratorial de NAbs
Teste de neutralização de redução de placas (PRNT)
Teste de neutralização com pseudovírus
Um vetor viral, por exemplo o VSV, é combinado com proteínas de membrana de outro vírus, dando origem a um pseudovírus. Geralmente, as partículas híbridas não possuem nenhum material genético.
Um exemplo de teste é o que usa um pseudovírus contendo uma molécula luminescente, como a luciferase, em seu interior.
O soro do paciente é adicionado numa cultura de células, por exemplo células HEK293T. Espera-se o período de incubação.
Quando os NAbs estão presentes no soro do paciente, o pseudovírus não liga-se ao receptor e a molécula luminescente não é detectada nas células da cultura. Ou seja, ausência de luminescência.
Quando os NAbs não estão presentes, a molécula luminescente entra nas células da cultura e ficam luminescentes. Ou seja, não haviam NAbs na amostra para neutralizar os pseudovírus.
Para (semi)quantificar os NAbs, é feita uma titulação com várias diluições do soro do paciente. Ou seja, várias culturas de células são testadas com diferentes diluições do soro do mesmo paciente.
O título do NAb é expresso como a maior diluição que neutralizou a dose teste do vírus.
ELISA
Para o SARS-CoV-2, existem também kits de ELISA em que a presença de NAbs é pesquisada.
Como já é sabido que na COVID-19 os NAbs são específicos para o domínio RBD da proteína S, esses imunoensaios podem detectar os anticorpos específicos para essa região.
Geralmente, os testes são qualitativos. Ou seja, detectam somente a presença ou ausência dos NAbs na amostra do paciente.
Em um kit de ELISA competitiva, por exemplo, utiliza-se ECA2 adsorvida na placa e o RBD marcado com peroxidase (HRP).
Sem os NAbs na amostra, ocorre interação entre RBD-HRP e ECA2. O resultado é o desenvolvimento de cor utilizando o substrato TMB (mais cor).
Porém, se presentes na amostra, os NAbs ligam-se ao RBD-HRP. Eles bloqueiam a interação entre RBD-HRP e ECA2 (competição).
A absorbância das amostras é inversamente proporcional à concentração de NAbs (quanto mais NAbs menor a absorbância/menos cor).
Referências
Alan L. Schmaljohn, “Protective Antiviral Antibodies that Lack Neutralizing Activity: Precedents and Evolution of Concepts”, Current HIV Research 2013; 11(5) . https://doi.org/10.2174/1570162X113116660057
Biomedicina Padrão. Resposta imunológica contra os vírus. 2020.
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Maeda A, Maeda J. Review of diagnostic plaque reduction neutralization tests for flavivirus infection. Vet J. 2013;195(1):33-40. doi:10.1016/j.tvjl.2012.08.019
Creative Diagnostics. SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Assay Kit.