A técnica de nocaute gênico permite que genes mutados in vitro e inseridos, durante o desenvolvimento embrionário no blastocisto, originem camundongos deficientes na produção da molécula induzida pelo gene.

Hoje pode-se mutar qualquer gene, impedindo que ele seja expresso de forma adequada, sendo assim possível observar o que a falta desse gene pode causar no organismo. Várias funções das citocinas, de moléculas co-estimulátorias têm sido estudadas, em diferentes modelos experimentais, por meio desta técnica.

Para que seja produzido um camundongo nocauteado, a primeira etapa consiste na clonagem do gene e da sua modificação in vitro. Estas modificações são obtidas pela inserção de dois genes, o da resistência a neomicina e o da timidina quinase (tk), do vírus herpes.

Após a mutação, estes genes são inseridos num vetor e introduzidos em células embrionárias primordiais (ES – Embryonic Stem Cells) de camundongo. Estas células são capazes de originar qualquer tipo de tecido.

Para que ocorra seleção das células, elas são cultivadas em meio contendo neomicina e ganciclovir. As células que sofreram recombinação homóloga do gene mutado apresentam resistência a neomicina e por não expressarem a tk são resistentes ao ganciclovir e sobrevivem.

Na  próxima  etapa,  estas  células  sobreviventes são inseridas in vitro em blastocisto de camundongo  fêmea de cor de pelagem diferente daquela da qual foram coletadas as células embrionárias.

A utilização de camundongos de pelagens diferentes é importante para a identificação dos camundongos quiméricos que herdaram os genes mutantes: estes apresentam um padrão mesclado de cor de pelagem, possibilitando o reconhecimento dos animais corretos.

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA. CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS